生化培養(yǎng)箱中煙草根際固氮菌的篩選、鑒定及生化培養(yǎng)

氮是烤煙生長過程中重要的營養(yǎng)元素之一，通過生化培養(yǎng)箱低溫培養(yǎng)與研究得出：在烤煙吸收的氮營養(yǎng)中，60% 以上來自于土壤，肥料氮僅占總氮量的35% 左右，因此，提高土壤供氮量對烤煙獲得高產(chǎn)具有重要的實踐意義。自生固氮菌是一類生活在土壤有機(jī)質(zhì)中促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌。本試驗篩選出的固氮菌都屬于自生固氮菌，均為桿菌。蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌都是具有固氮功能的細(xì)菌。

　　N7 的16S 序列與Bacillus megaterium 相似性達(dá)到98%，可推斷這個菌株是巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌是一種益生菌，在20 世紀(jì)40 年代，巨大芽孢桿菌就已進(jìn)行實驗研究，學(xué)者Sundar、Molla 以及Ellott 等發(fā)現(xiàn)以巨大芽孢桿菌為核心制成混合菌劑，可降解難以溶解的含磷化合物。1958 年Hin 在日本分離得一株具有高固氮活性的巨大芽孢桿菌，相對于生物肥料來說，巨大芽孢桿菌具有自身*的優(yōu)良特點，其生存能力及適應(yīng)能力較強(qiáng)，對于在非人工氮素供應(yīng)上這類菌株將起著十分重要的作用。巨大芽孢桿菌不僅具有高效降解煙草中亞硝酸鹽的功能，更有研究表明由巨大芽孢桿菌制成的微生物制劑噴灑在煙草葉片上，能有效的提高葉片的香味，并且降低蛋白質(zhì)含量，對煙草的品質(zhì)有很大提高。并且巨大芽孢桿菌與節(jié)桿菌雙菌種共同作用能有效提高廢次煙葉的綜合利用和煙草薄片質(zhì)量，這對煙草企業(yè)有巨大的經(jīng)濟(jì)意義。

　　N2、N5、N6、N9、N10 的16S 序列與Bacillussubtilis 相似性達(dá)到98%，由此可推斷這幾個菌株是枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是一種益生菌，不僅能夠提高植物種子的發(fā)芽率，更具有固氮活性。目前有研究表明，枯草芽孢桿菌是一種內(nèi)生固氮菌，定殖在宿主植物體內(nèi)，直接分泌固氮產(chǎn)物給植物吸收，不易受到外界環(huán)境條件的干擾，更有利于充分發(fā)揮固氮效能，表現(xiàn)出更高的固氮效率。在甘蔗內(nèi)生固氮菌的研究中，證實了枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的高效固氮活性。English 等研究顯示，煙葉分別或混合接種枯草芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌后，能迅速產(chǎn)生一種令人愉悅的香氣。并且研究表明利用枯草芽孢桿菌還可以高效防治煙草青枯病。N1 的16S 序列與Bacillus thuringiensis 相似性達(dá)到99%，由此可推斷該菌為蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌不僅常用作微生物殺蟲劑，也具有高效固氮功能。N4、N8、N12 的16S 序列與Bacillusmethylotrophicus 相似性達(dá)到99%，由此可推斷這幾個菌是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，具有高效固氮功能。但是目前對蘇云金芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的固氮功能研究相對較少，這兩個菌種的固氮活性需要做進(jìn)一步的研究。ARDRA 的分析結(jié)果大致一致，證實了我們分類的正確性。

　　本試驗對巨大芽孢桿菌的適宜培養(yǎng)條件、適pH 值等進(jìn)行了研究。把蔗糖作為N7 的碳源進(jìn)行下一步的研究。與蔗糖相比，葡萄糖屬于單糖，一般較容易被細(xì)菌利用，但在其代謝過程中產(chǎn)酸速度較快，從而使得培養(yǎng)基pH 值快速降低，這可能是導(dǎo)致其生長量較蔗糖低的主要原因。N7 快速生長的初始pH 值為7.50，菌株在中性或偏堿性的條件下生長好，這與文獻(xiàn)報道的植物生長促生菌的適宜培養(yǎng)條件一致。在低溫培養(yǎng)中，N7 的適生長溫度是30℃，可能是由于較低的溫度（25℃），菌體新陳代謝較慢，導(dǎo)致菌生長和分裂速度受影響；較高的溫度（40℃），由于該溫度超過了菌體內(nèi)酶的適溫度，使得其催化效率有所下降，從而影響了細(xì)菌的生長。